普朗医疗器械公司科技——结核病的细菌学检查目前是结核病实验室诊断的金标准。通过血液细胞分析仪研究，由于痰涂片阳性率较低，镜检需要经验，难以区分环境分枝杆菌造成的假阳性；痰培养需时太长，因此细菌学检查对结核病的诊断价值有限。随着分子生物学技术的迅速发展，用高度敏感的方法检测结核菌及其特异性DNA片段，如PCR、生物探针和基因芯片等，需要相应的检测设备和检测费用高未能广泛推广。血清学诊断技术有其固有的优势，如操作简便、快速、便于推广、无需特殊精密血液分析仪器，已有多种纯化的特异性抗原可采用，可以发展成自动化检测，尤其是对痰培养阴性和肺外结核病有较为重要的辅助诊断价值，受到广泛的重视。本文从靶抗原的选择和检测技术的改进等方面综述了结核病血清学诊断的现状和进展。

    血清学诊断技术的发展

    在结核病血清学诊断过程中发现单一抗原无法产生令人满意的诊断结果，多克隆抗原“鸡尾酒”的应用，有助于血清学诊断特异性和敏感性的提高。 ELISA方法简便易行，快速又无需特殊精密仪器，在结核病血清学诊断方面研究最多，应用最广并在技术上进行了多方面的改进。另外，免疫印迹技术、蛋白芯片技术等检测血清抗体方法，为结核病的诊断提供了有价值的手段。

    1.联合应用结核抗原 将结核特异性的抗原联合或者几种特异蛋白融合成多聚蛋白复合物用于检测能提高诊断能力，不影响诊断特异性，而比单一抗原法具有更高的敏感性。Okuda等回顾性地分析了三种结核病血清学诊断抗原TBGL、LAM、A60在活动性肺结核中的应用，其敏感性分别为70.1%、67.5%、70.9%，特异性分别为92.5%、97.5%、95.0%。三种抗原联合检测其敏感性提高到91.5%，特异性降为87.5%。Houghton等报道用病人的血清从结核分枝杆菌基因组表达文库中鉴定出Mtbll(即CFP-10)、Mtb8、Mtb48和DPEP(富含脯氨酸的蛋白)，并得到各自的重组蛋白。通过血液细胞分析仪检测，将 Mtbl1、Mtb8与38kDa蛋白的编码基因重组构建经大肠埃希菌表达为多表位的蛋白聚合体TbF10，在此基础上，又加入Mtb48构建成蛋白聚合体TbF6，两者用于诊断，比单一抗原法的灵敏度都有所提高，再加入DPEP则能显著提高检测的灵敏度。多抗原“鸡尾酒”诊断方法有利于节约生产和检测成本，如进一步优化抗原组合，可以在发展中国家推广使用。

    2.循环免疫复合物(CIC)测定 特异性循环免疫复合物的检测是结核病血清学诊断中的另一重要领域。活动性结核病人特异性IgG类免疫复合物明显增加，并随病情的好转而下降，故检测血清、脑脊液、胸腹水中的结核特异性免疫复合物对活动性结核的诊断也有重要的意义。经血液分析仪研究，部分活动性肺结核病人痰菌检查阳性，而血清结核抗体测定为阴性，其原因之一就是形成CIC所致。因此，众多的研究者认为检测结核病人CIC含量有助于结核病的辅助诊断。检测CIC最简便的方法为酶标法。CIC-ELISA特异性比痰涂片要高，尤其对不易得到痰标本的儿童结核和肺外结核效果较好。

    3.免疫印迹技术 免疫印迹技术是高分辨的SDS-PAGE技术与高敏感性的酶联反应技术的结合产物。目前，该技术已被转化成产品，操作者只要通过后半步骤的酶联免疫反应，即可检出待检标本中所含的多种结核分枝杆菌多肽抗原成分的特异性抗体。北京生产的TB-40结核抗体免疫印迹法检测试剂盒选取的抗原来自于结核分枝杆菌全菌，并筛选出最具免疫原性及特异性高的蛋白成份做为诊断抗原，大幅度提高了诊断准确性，并可做为结核病诊断的确证实验。用于检测痰菌阳性结核患者、痰菌阴性结核患者、肺外结核病的敏感性分别为93%、86%、89%，特异性超过95%。

    4.酶联免疫斑点(ELISpot)技术 ELISpot技术是检测细胞分泌细胞因子的一种实验方法，采用可定量的夹心ELISA方法，通过ELISpot酶联斑点分析系统对加底物后形成的斑点分析后得出结果。ELISpot具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用。英国Ewer等用ELISpot检测对结核分枝杆菌分泌的抗原有特异性反应的T淋巴细胞来诊断早期结核病。经过血细胞分析仪研究，这项研究共纳入了结核流行区有不同程度结核病接触史的535名学生，结果显示结核菌素皮肤试验(TST)和 ELISpot的一致性达89%(P<0.0001)。但ELISpot与研究对象结核病接触程度之间的正相关性显著强于TST。在接种过BCG的儿童中，TST假阳性的可能性较大，而BCG接种对ELISpot结果没有影响。作者认为ELISpot可开始替代TST，这将使更多的人能在感染仍处于隐匿期时就可进行预防，而不至于发展成为严重的结核病。

    5.蛋白芯片技术 蛋白芯片技术借助于高通量蛋白检测技术平台，将结核分枝杆菌多种抗原固相于同一微孔滤膜并利用微孔滤膜的渗滤、浓缩、凝集作用，使抗原抗体反应在固相膜上快速进行，然后以免疫金作为标记物直接在膜上显色。再以蛋白芯片阅读仪自动扫描膜上颜色，建立多种结核抗原的蛋白芯片检测系统。该检测系统具有以下优点: 操作简便、快速，病人血清分离出来后，只需5分钟就可以为临床提供有价值的实验资料；敏感性高，特异性强，符合临床辅助诊断要求；结果的判断采用芯片识别阅读仪，避免了人为判读时的主观误差。

    6.体液中结核抗原或抗体的检测 结核抗体检测技术已日趋成熟，测定的标本除血清外还有脑脊液、胸腹水、痰、灌洗液和尿液等。Singh等联合检测尿液和血清中抗体诊断结核病有很高的灵敏度，为进一步研究检测尿液中的抗体诊断结核病打下了基础。由于机体受到结核分枝杆菌感染后，体内首先出现的是结核抗原，而结核抗体则要感染后8周起逐渐产生，因此检测结核抗原具有早期诊断价值。尤其对结核性脑膜炎的快速诊断、对器官移植术后并发结核感染的确定和对肺结核与肺癌的鉴别诊断等尤为重要。目前，有关结核抗原检测的研究国内外均有报道，其中尤以脑脊液结核抗原检测的研究较多。Song等用抗结核分枝杆菌过氧化氢酶-过氧化物酶（mKatG）单克隆抗体，采用蛋白印迹技术来检测病人组织中的mKatG抗原，其敏感性为55%，特异性为100%。痰标本中的结核抗原检测也有报道，但技术问题较多，因为痰是不均匀的粘胶样半流性液体，很难准确测定。

    展望

    现有结核病的诊断方法并未能满足临床需要，未来结核病诊断试剂的发展更加强调简单、价廉、快速、敏感而且特异，且对特定的人群要有特定的检测诊断方法。目前我们应加强下述内容的研究：①发现更多的特异性抗原联合用于检测：由于结核分枝杆菌抗原结构复杂，分枝杆菌属中各种细菌之间抗原性存在广泛的交叉，因此应结合分枝杆菌基因组学和比较基因组学的成果，着重于结核分枝杆菌特异性抗原的分析和纯化；②加强血细胞分析仪测定方法的研究，进一步提高检测方法的敏感性和特异性：要对方法的最佳测定条件、可能的影响因素等进行细致研究；要通过大量标本的测定结果比较，选择最佳测定方法，并使之在基层推广应用；要研究定量测定，尽可能用仪器判断结果，以避免人为测定误差；③加强对特定的人群如痰涂片阴性病人、合并HIV感染者、老年患者或隐性感染者、肺外结核病和儿童结核病等特定的检测诊断方法的研究；④加强对除痰外的多种体液检测的研究，如尿液，容易收集且无创，特异，是未来结核病血清学诊断的方向。

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